[出处] 教育教学论坛_2022年第15期

牛晓磊 冯世鹏 蒋凌雁 王倩男 陈银华

[关键词] 分子生物学实验课程;教学改革;问题导向

[基金项目] 2019年度海南省高等学校教育教学改革研究项目“分子生物学课程教学内容及实验体系整体优化”（Hnjg2019ZD-2）;2019年度海南大学教育教学改革研究项目“分子生物学课程教学内容及实验体系整体优化”（hdjy1926）;2020年度教育部新农科研究与改革实践项目“热带新农科多样化人才培养体系研究与实践”（NDE2020-20）（教高厅函〔2020〕20号）

[作者简介] 牛晓磊（1979—），男，河南安阳人，博士，海南大学热带作物学院副教授，主要从事热带作物遗传育种研究;冯世鹏（1980—），男，湖北孝感人，博士，海南大学热带作物学院副教授，主要从事热带作物遗传育种研究;蒋凌雁（1989—），女，湖南长沙人，博士，海南大学热带作物学院副教授，主要从事热带作物与病原菌互作研究。

[中图分类号] G642.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-9324（2022）15-0097-04 [收稿日期] 2021-09-27

“分子生物学”是生物科学、生物技术专业的核心主干课程，在其他生物相关专业有类似的课程如“基因克隆”“生物技术概论”等选修课。因此，分子生物学相关理论与技术是生物类相关专业学生重点学习内容之一。而分子生物学实验既能锻炼学生的动手能力，又能加深学生对理论知识的掌握程度。分子生物学实验教学模式与教学方法的改革是目前分子生物学教学改革的重点[1]。

海南大学“分子生物学”课程选择的教材是朱玉贤主编的《现代分子生物学》[2]，实验内容是根据《分子克隆实验指南》[3]选编的内容。分子生物学及其实验的教学改革在不同地区均有一些尝试，在教材选择、教师配制、翻转课堂、双语教学、案例教学等方面均有应用，并取得了一定的成效[4]。目前的分子生物学实验课程，多数的流程仍然是教师讲解，包括实验原理、材料方法、实验步骤、注意事项等;学生听完后进行实验操作，主要是根据老师的讲解机械模仿。然而笔者在长期的教学实践过程中发现，虽然实验前对实验内容进行了详细讲解，然而大多数学生对相关分子生物学的实验原理缺乏了解，实验操作照葫芦画瓢的机械模仿较多，对老师的实验设计不理解，实验过程中出现的现象无法解释，既不知道实验为什么成功，也不知道实验为什么失败。这就如同小朋友走路，无论告诉他们多少走路方法、注意事项，他自己走路的时候还是会摔跤;而他自己在走路的过程中，摸爬滚打，无意识中总结经验教训，终于学会了走路。有鉴于此，笔者设计了一套以问题为导向的分子生物学实验教学改革方案，发现效果很好。

一、改革内容

改革内容主要包括两方面：一是改革实验教学过程;二是改革学生成绩评价方法。教学过程的改革措施主要包括如下几方面。

（一）教學时间控制

实验教学一般安排在上午或者下午，总时长约3～4节课，为了充分利用实验课堂时间，要求学生必须课前预习实验内容，并设计实验过程;课堂上进行实验操作及失败后的重复实验操作;实验中间或实验过程中遇到问题随时与教师进行探讨;实验课后进行总结报告。

（二）制造问题

有两方面的问题：一是学生自己制造的问题，二是老师针对性地提出的问题。先让学生根据本次课程的实验内容自己设计实验整个流程，然后直接进行实验操作，但由于学生缺乏知识及经验，实验过程中必然出现许多问题。至于老师提出的问题，主要是根据学生实验的进展情况与对实验所用到的知识的理解，针对性地提出一些问题。

（三）分析原因

学生实验过程中产生的问题实际上激发了学生的自主学习欲望，学生在自己的实验中碰到问题时，会迫切地想知道为什么会产生这样的结果，以及怎样避免或者解决，怎么进行下一步等。学生在这个过程中会进行自我思考，此时老师与学生一起分析原因，通过此过程实际上教师将实验原理及实验注意事项等知识传授给了学生，这比实验前填鸭式的讲解效果好很多。

（四）设计实验

出现了问题，分析了问题可能的原因，接下来就是跟着学生一起设计实验，对可能的原因进行验证。此时给学生讲授如何设计实验，为什么要这样设计，学生更能理解实验设计的过程及原理。

（五）解决问题

根据实验设计方案再次进行实验，这个过程一般能全部或者至少部分解决之前的问题;有时候也可能产生新的问题。无论是之前未解决的问题还是新产生的问题，再次回到第二步，依次进行分析原因—设计实验—再次验证等步骤。如此往复，学生学到了相关知识与技术，同时掌握了分析问题、解决问题的能力。

对于学生成绩的评价方法，之前主要是以期末考试或者实验报告成绩为主要依据进行评价，笔者改为实验报告和实验总结，将学生的实验操作能力、分析问题和解决问题的能力在最终成绩上体现出来。

二、实例分析

分子生物学实验课共设计了8个子实验：RNA抽提、核酸电泳、cDNA合成、PCR扩增、扩增产物回收、载体连接转化、阳性克隆鉴定、质粒抽提及酶切鉴定。这8个实验基本涵盖了基因克隆全过程。掌握了该过程就基本掌握了分子生物学最基本的实验操作技术，对于再学习其他分子操作技术来说会相对容易。将实验中遇到的典型问题进行举例说明。

（一）RNA抽提

该过程研钵的处理事先由课程教辅教师代为处理好;RNA抽提试剂盒是新购入且未开封，且已经过本实验室研究生使用证明试剂盒可用;研磨过程需要液氮，有一定的危险性，提前告知他们液氮使用注意事项。在此基础上，学生根据提供的RNA抽提试剂盒的说明书，设计实验步骤，并完成了第一次抽提实验。所抽提的RNA电泳结果（图 1A）显示在最上面有一条带，下面有一条长的拖尾，这个结果与之前理论课告诉学生总RNA的电泳带形完全不同。问题产生了：为什么这样？这些带是什么？哪里出问题了？这个RNA能用吗？下一步怎么办？……

A：第一次RNA抽提电泳图;B：第二次RNA抽提电泳图;C：第一次PCR产物电泳;D：第二次PCR产物电泳;泳道1：DL2000markers;泳道2、3：两个重复样抽提RNA;泳道4、7、10：DL5000markers;泳道5、6：两个重复样抽提RNA;泳道8、9：两个重复样抽提RNA后的RT-PCR扩增Actin基因;泳道11：基因A PCR产物;泳道12：基因A阴性对照;泳道13：基因B PCR产物;泳道14：基因B阴性对照;泳道15：Actin基因PCR产物;泳道16：Actin基因阴性对照。

分析问题：首先，marker是DL2000，共6条带，最小100bp，最大2000bp，最亮的带是750bp，这些条带是清晰完整的（图1A，泳道1），因此电泳相关试剂及电泳过程是没问题的;上样缓冲液的蓝色染料，肉眼可见，可监测电泳进度，该染料仍在胶上，证明无条带跑出胶;EB荧光染料与核酸结合后在紫外光激发可发射荧光从而查看核酸带形;RNA电泳应该看到的带从大至小应该是28S（约1600bp，最亮）、18S（约800bp）、5S（约100bp，暗或无），而学生的电泳图最大的带位置已经超过2000bp，很明显该条带是基因组，下面的拖尾是总RNA降解后的一系列片段。因此，抽提的核酸包括DNA、RNA，但RNA容易降解。那么哪里出问题了？让学生回想一下操作过程，口罩、手套使用合规吗？所有接触样品的试剂耗材有去RNAase处理吗？这些问题只能学生自己找答案，学生总结原因：一是操作不熟练，可能有些细节没注意;二是围观的人多，且有交谈，可能是唾液中的RNase影响。这个RNA能用吗？如果是进行RNA定量检测是没有完全必要的;因为本次实验是进行基因克隆，目标基因未完全降解就可用。下一步怎么办？两手准备，一是将RNA反转录为cDNA后进行目标基因扩增;二是根据自己总结的问题，重新设计方案进行RNA抽提。

设计实验：一是默认目标基因RNA未完全降解，继续设计cDNA反转录及PCR实验;二是根据自己找的RNA抽提过程的问题，重新进行RNA抽提。

实验验证：学生首先进行反转录及PCR实验，实验步骤也是学生自己设计的。学生首先用Actin基因进行PCR扩增（理论PCR产物276bp），结果（图1C）扩增出Actin基因，且大小符合预期，说明RNA确实含部分未完全降解RNA。在RNA的重新抽提方面，学生根据总结的原因，选中两个操作相对熟练的人进行再次RNA抽提，并禁止其他人围观交谈;同时再次仔细阅读试剂盒说明书，严格按照试剂盒说明书进行操作。第二次RNA抽提试验结果（图1B）显示，其中总RNA的含量明显好于第一次，说明他们自己总结的经验教训是有效果的。

（二）PCR扩增

学生用第一次抽提的有部分降解的RNA为模板，进行反转录并扩增Actin基因，结果（图1C）成功扩增出条带。学生兴奋地问：“这说明第一次抽提的RNA是可用的吧？”笔者迅速指出他们的设计存在的问题：一是由于Actin作为阳性对照基因表达量相对比较高，能PCR扩增出Actin基因并不能完全說明第一次抽提的RNA可用，应该增加其他目标基因;二是Actin基因的理论PCR产物仅275bp，有时无法与引物二聚体区分开，因此应该同时加上阴性对照，在这里同时将阳性对照、阴性对照的作用进行了详细的讲解，看得出来学生有豁然明白的感觉。同时提醒学生，从RNA电泳及Actin扩增结果，学生提RNA的两个重复样，RNA质量一致，后续的实验选其中一个样本进行即可，节约时间与成本。

设计实验：学生根据他们自己提出的问题及与教师一起分析探讨的结果，再次进行了实验设计，选择了基因A（1074bp）、基因B（1181bp）及Actin基因进行PCR扩增。

实验验证：再次PCR实验结果（图1D）显示，基因A、基因B、Actin均扩增出条带，且三个基因的阴性对照无条带或者含引物二聚体条带，说明第一次抽提的RNA可以用来进行靶标基因克隆模板用。学生已经初步具备了分析问题、解决问题的能力。同时不可避免的，新的问题也产生了，为什么基因A有四条带（图1D，泳道11），除了最下面的二聚体带，其他带是什么？基因B有三条带（图1D，泳道13），除了二聚体带，其他带是什么？如何去掉多余的带？

再次分析问题：对于基因A（图1D，泳道11）来说，目标条带是1074bp，最上面的带与DL5000 marker的最亮的1000bp带基本持平，因此这条带就是基因克隆的目标条带;最下面的带在100bp左右，应该是二聚体带，基因A的阴性对照也有此带（图1D，泳道12），进一步说明该带为二聚体带;其他两条带是非特异扩增的杂带。基因B与基因A情况类似（图1D，泳道13），只是少一条杂带而已。杂带产生的原因是基因克隆要求引物能扩增CDS全长，因此引物可供选择余地小，容易产生非特异扩增的杂带。至于如何去掉杂带，有几种办法：一是重新设计引物，但是对引物的限制条件仍在，该方法常常不易成功;二是提高PCR步骤中的退火温度，该方法可部分缓解杂带问题，常常无法根除;三是进行切胶回收，将目标条带单独切出来，再进行胶回收，该方法同时可以去除PCR过程加入的酶及其他杂质，是目前解决此类问题的常用办法。通过这样的方法，让学生自己设计实验—分析实验结果—找出问题—再次设计实验—验证解决问题，如此循环往复，完成整个分子生物学所设置的几个实验。学生通过自己的摸爬滚打，一边摸索实验，一边解决实验问题，对实验操作过程印象深刻，对所学的知识也终生难忘，同时学会了分析问题、解决问题的能力。更难能可贵的是学生对生命科研探索充满了热情，达到了实验课程设计的初衷。

三、课程考核方法改革

无论是以期末考试为主，还是以实验报告为主的考核方法，会让记忆能力强、字迹较为工整的学生占有一定优势，但是这些学生在动手能力方面并不突出。反而是那些平时理论课成绩并不是很好的学生，表现出较强的实验操作能力及分析问题解决问题的能力。

实验操作能力可通过平时课堂观察，那些操作较多的学生、实验观察较仔细的学生在进行实验课程总结的时候，会写出生动、真实、身临其境的感受。在总成绩的组成部分中，平时出勤占10%，课堂表现占20%，课程总结占30%，实验报告占40%。提高实验操作能力及分析问题、解决问题的能力所占的比重，让真正热爱本专业、肯钻研、动手能力强的学生得高分，鼓励大家仿效，提高实验课程训练效果。从教学改革的成果来看，大部分学生较扎实地掌握了课程实验相关的理论与技术，并具备了一定程度的分析问题、解决问题的能力，增强了他们学习与工作的自信心，一部分学生甚至因此爱上了科研，并投入考研准备中。